kallisto怎么使用

发布时间：2021-12-18 14:54:20 作者：iii
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Kallisto 怎么使用

Kallisto 是一个用于 RNA-Seq 数据分析的轻量级工具，它基于伪比对（pseudoalignment）算法，能够快速、准确地估计转录本的丰度。Kallisto 的设计目标是简化 RNA-Seq 数据分析流程，同时保持高精度和高效率。本文将详细介绍 Kallisto 的使用方法，包括安装、基本命令、参数解释以及常见的使用场景。

1. 安装 Kallisto

Kallisto 支持 Linux、macOS 和 Windows 操作系统。以下是安装 Kallisto 的步骤：

1.1 Linux 和 macOS

对于 Linux 和 macOS 用户，可以通过以下命令从源代码编译安装 Kallisto：

# 克隆 Kallisto 仓库
git clone https://github.com/pachterlab/kallisto.git

# 进入 Kallisto 目录
cd kallisto

# 创建 build 目录并编译
mkdir build
cd build
cmake ..
make

编译完成后，Kallisto 可执行文件将位于 build/src 目录下。你可以将其添加到系统的 PATH 环境变量中，以便在任何目录下使用。

1.2 Windows

对于 Windows 用户，可以从 Kallisto 的 GitHub 发布页面下载预编译的二进制文件，并将其添加到系统的 PATH 环境变量中。

2. 基本命令

Kallisto 提供了几个主要的命令，用于不同的 RNA-Seq 数据分析任务。以下是常用的命令及其功能：

kallisto index: 构建转录本索引。
kallisto quant: 估计转录本丰度。
kallisto bus: 用于单细胞 RNA-Seq 数据分析。

2.1 构建转录本索引

在使用 Kallisto 进行 RNA-Seq 数据分析之前，首先需要构建转录本索引。索引文件将用于后续的伪比对和丰度估计。

kallisto index -i <index_name> <transcriptome.fa>

-i <index_name>: 指定索引文件的名称。
<transcriptome.fa>: 转录本序列文件，通常为 FASTA 格式。

例如：

kallisto index -i transcriptome.idx transcriptome.fa

2.2 估计转录本丰度

构建索引后，可以使用 kallisto quant 命令估计转录本的丰度。Kallisto 支持单端和双端测序数据的分析。

2.2.1 双端测序数据

对于双端测序数据，使用以下命令：

kallisto quant -i <index_name> -o <output_dir> <reads_1.fastq> <reads_2.fastq>

-i <index_name>: 指定之前构建的索引文件。
-o <output_dir>: 指定输出目录。
<reads_1.fastq> 和 <reads_2.fastq>: 双端测序数据的 FASTQ 文件。

例如：

kallisto quant -i transcriptome.idx -o output_dir reads_1.fastq reads_2.fastq

2.2.2 单端测序数据

对于单端测序数据，使用以下命令：

kallisto quant -i <index_name> -o <output_dir> --single -l <fragment_length> -s <fragment_std> <reads.fastq>

--single: 指定单端测序数据。
-l <fragment_length>: 指定片段长度。
-s <fragment_std>: 指定片段长度的标准差。
<reads.fastq>: 单端测序数据的 FASTQ 文件。

例如：

kallisto quant -i transcriptome.idx -o output_dir --single -l 200 -s 20 reads.fastq

2.3 单细胞 RNA-Seq 数据分析

Kallisto 还支持单细胞 RNA-Seq 数据分析，使用 kallisto bus 命令。该命令将生成一个 BUS 文件，用于后续的单细胞数据分析。

kallisto bus -i <index_name> -o <output_dir> <reads_1.fastq> <reads_2.fastq>

-i <index_name>: 指定之前构建的索引文件。
-o <output_dir>: 指定输出目录。
<reads_1.fastq> 和 <reads_2.fastq>: 双端测序数据的 FASTQ 文件。

例如：

kallisto bus -i transcriptome.idx -o output_dir reads_1.fastq reads_2.fastq

3. 参数解释

Kallisto 提供了丰富的参数选项，用于控制分析过程。以下是一些常用参数的详细解释：

3.1 `kallisto index` 参数

-i <index_name>: 指定索引文件的名称。
<transcriptome.fa>: 转录本序列文件，通常为 FASTA 格式。

3.2 `kallisto quant` 参数

-i <index_name>: 指定之前构建的索引文件。
-o <output_dir>: 指定输出目录。
--single: 指定单端测序数据。
-l <fragment_length>: 指定片段长度（仅用于单端测序数据）。
-s <fragment_std>: 指定片段长度的标准差（仅用于单端测序数据）。
-b <bootstrap_samples>: 指定 bootstrap 样本数，用于估计丰度的不确定性。
-t <threads>: 指定使用的线程数。

3.3 `kallisto bus` 参数

-i <index_name>: 指定之前构建的索引文件。
-o <output_dir>: 指定输出目录。
-x <technology>: 指定单细胞测序技术（如 10xv2、10xv3 等）。

4. 常见使用场景

4.1 批量处理多个样本

在实际的 RNA-Seq 数据分析中，通常需要处理多个样本。可以使用 shell 脚本批量调用 Kallisto 命令。例如：

for sample in sample1 sample2 sample3; do
    kallisto quant -i transcriptome.idx -o ${sample}_output ${sample}_1.fastq ${sample}_2.fastq
done

4.2 结合下游分析工具

Kallisto 的输出文件可以与其他下游分析工具结合使用。例如，可以使用 sleuth 进行差异表达分析。sleuth 是一个专门为 Kallisto 设计的 R 包，用于分析 RNA-Seq 数据的差异表达。

library(sleuth)

# 读取 Kallisto 输出
s2c <- read.table("sample_info.txt", header=TRUE, stringsAsFactors=FALSE)
so <- sleuth_prep(s2c, ~ condition)
so <- sleuth_fit(so)
so <- sleuth_wt(so, 'conditionB')
results_table <- sleuth_results(so, 'conditionB')

5. 总结

Kallisto 是一个高效、易用的 RNA-Seq 数据分析工具，特别适合处理大规模的转录组数据。通过本文的介绍，你应该已经掌握了 Kallisto 的基本使用方法，包括安装、构建索引、估计转录本丰度以及处理单细胞 RNA-Seq 数据。希望这些内容能帮助你在 RNA-Seq 数据分析中取得更好的结果。