怎么使用tophat-fusion鉴定融合基因

引言

融合基因（Fusion Gene）是指两个或多个基因的编码序列在基因组重排或转录过程中发生融合，形成一个新的嵌合基因。融合基因在癌症等疾病中扮演着重要角色，因此准确鉴定融合基因对于疾病诊断和治疗具有重要意义。TopHat-Fusion 是一个基于 RNA-seq 数据的融合基因检测工具，能够高效地识别潜在的融合基因事件。本文将详细介绍如何使用 TopHat-Fusion 进行融合基因的鉴定。

1. 准备工作

1.1 安装 TopHat-Fusion

首先，确保已经安装了 TopHat 和 Bowtie2。TopHat-Fusion 是 TopHat 的一个扩展模块，因此需要先安装 TopHat。

# 安装 Bowtie2
sudo apt-get install bowtie2

# 安装 TopHat
sudo apt-get install tophat

1.2 下载参考基因组和注释文件

TopHat-Fusion 需要参考基因组和基因注释文件来进行比对和融合基因的检测。可以从 UCSC 或 Ensembl 等数据库下载所需的参考基因组和 GTF 文件。

# 下载参考基因组
wget http://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg38/bigZips/hg38.fa.gz
gunzip hg38.fa.gz

# 下载基因注释文件
wget http://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg38/bigZips/genes/hg38.ensGene.gtf.gz
gunzip hg38.ensGene.gtf.gz

1.3 构建 Bowtie2 索引

使用 Bowtie2 为参考基因组构建索引。

bowtie2-build hg38.fa hg38

2. 运行 TopHat-Fusion

2.1 准备输入文件

TopHat-Fusion 的输入文件是 RNA-seq 数据的 FASTQ 文件。假设我们有一对 paired-end 的 FASTQ 文件 sample_1.fastq 和 sample_2.fastq。

2.2 运行 TopHat-Fusion

使用以下命令运行 TopHat-Fusion：

tophat -o tophat_output -p 8 --fusion-search --keep-fasta-order --bowtie1 --no-coverage-search hg38 sample_1.fastq sample_2.fastq

参数说明： - -o tophat_output：指定输出目录。 - -p 8：使用 8 个线程进行并行计算。 - --fusion-search：启用融合基因检测。 - --keep-fasta-order：保持参考基因组的顺序。 - --bowtie1：使用 Bowtie1 进行比对。 - --no-coverage-search：禁用覆盖度搜索。

2.3 检查输出文件

运行完成后，TopHat-Fusion 会在输出目录中生成多个文件，其中最重要的是 fusions.out 文件，该文件包含了检测到的融合基因信息。

cat tophat_output/fusions.out

fusions.out 文件的格式如下：

gene1   gene2   chr1    pos1    strand1 chr2    pos2    strand2 num_reads   num_spanning_reads

每一行代表一个检测到的融合基因事件，包括两个基因的名称、染色体位置、链方向、支持该融合事件的 reads 数量等。

3. 结果解读与验证

3.1 解读 fusions.out 文件

fusions.out 文件中的每一行代表一个潜在的融合基因事件。需要关注以下几个关键字段： - gene1 和 gene2：融合的两个基因名称。 - chr1 和 chr2：融合基因所在的染色体。 - pos1 和 pos2：融合位点的位置。 - num_reads 和 num_spanning_reads：支持该融合事件的 reads 数量。

3.2 验证融合基因

为了确保检测到的融合基因是真实的，可以使用以下方法进行验证： - PCR 验证：设计特异性引物，通过 PCR 扩增融合位点，并进行 Sanger 测序验证。 - RNA-seq 数据可视化：使用 IGV 等工具查看融合位点的 reads 分布情况，确认融合事件的存在。

3.3 进一步分析

对于验证后的融合基因，可以进行以下进一步分析： - 功能注释：分析融合基因的功能，了解其在疾病中的作用。 - 表达量分析：比较融合基因在肿瘤和正常组织中的表达量差异。 - 临床相关性分析：分析融合基因与患者临床特征的相关性，评估其作为生物标志物的潜力。

4. 常见问题与解决方案

4.1 运行速度慢

TopHat-Fusion 的运行速度较慢，尤其是在处理大规模 RNA-seq 数据时。可以通过以下方法提高运行速度： - 增加线程数：使用 -p 参数增加线程数。 - 使用高性能计算集群：将任务提交到高性能计算集群上进行并行计算。

4.2 检测到的融合基因数量过多

TopHat-Fusion 可能会检测到大量的融合基因，其中很多可能是假阳性。可以通过以下方法减少假阳性： - 提高 reads 支持数阈值：在 fusions.out 文件中筛选出支持 reads 数量较多的融合基因。 - 结合其他融合基因检测工具：使用多个工具进行融合基因检测，取交集结果。

4.3 参考基因组版本不一致

确保参考基因组和基因注释文件的版本一致，否则可能导致比对错误和融合基因检测失败。

5. 总结

TopHat-Fusion 是一个强大的融合基因检测工具，能够从 RNA-seq 数据中高效地识别潜在的融合基因事件。通过本文的介绍，读者可以掌握如何使用 TopHat-Fusion 进行融合基因的鉴定，并对结果进行解读和验证。融合基因的鉴定对于疾病的研究和诊断具有重要意义，希望本文能为相关研究提供帮助。

参考文献

1. Kim, D., & Salzberg, S. L. (2011). TopHat-Fusion: an algorithm for discovery of novel fusion transcripts. Genome Biology, 12(8), R72.
2. Trapnell, C., Pachter, L., & Salzberg, S. L. (2009). TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq. Bioinformatics, 25(9), 1105-1111.
3. Langmead, B., & Salzberg, S. L. (2012). Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods, 9(4), 357-359.

通过以上步骤，您可以使用 TopHat-Fusion 进行融合基因的鉴定，并对结果进行详细的分析和验证。希望本文能为您的研究提供有价值的参考。