Trimmomatic怎么使用

概述

Trimmomatic 是一个用于 Illumina 平台高通量测序数据的快速、多线程的预处理工具。它能够有效地去除低质量的碱基、接头序列以及其它不需要的序列，从而提高后续分析的质量和准确性。Trimmomatic 支持单端和双端测序数据的处理，并且提供了多种灵活的过滤和修剪选项。

本文将详细介绍 Trimmomatic 的安装、基本使用方法、常用参数以及一些实际应用案例。

安装

系统要求

Trimmomatic 是一个基于 Java 的工具，因此需要 Java 运行环境（JRE）的支持。建议使用 Java 8 或更高版本。

下载与安装

1. 下载 Trimmomatic
   你可以从 Trimmomatic 官方网站 下载最新版本的 Trimmomatic。下载的文件通常是一个压缩包，解压后即可使用。

2. 解压文件
   使用以下命令解压下载的文件：

   tar -xvzf Trimmomatic-0.39.tar.gz

1. 设置环境变量
   为了方便使用，可以将 Trimmomatic 的路径添加到系统的环境变量中。编辑 ~/.bashrc 或 ~/.bash_profile 文件，添加以下内容：

   export TRIMMOMATIC_HOME=/path/to/Trimmomatic-0.39
   export PATH=$TRIMMOMATIC_HOME:$PATH

然后执行 source ~/.bashrc 使配置生效。

基本使用方法

单端数据修剪

对于单端测序数据，使用以下命令进行修剪：

java -jar $TRIMMOMATIC_HOME/trimmomatic-0.39.jar SE \
  -threads 4 \
  -phred33 \
  input.fastq.gz \
  output.fastq.gz \
  ILLUMINACLIP:$TRIMMOMATIC_HOME/adapters/TruSeq3-SE.fa:2:30:10 \
  LEADING:3 \
  TRLING:3 \
  SLIDINGWINDOW:4:15 \
  MINLEN:36

双端数据修剪

对于双端测序数据，使用以下命令进行修剪：

java -jar $TRIMMOMATIC_HOME/trimmomatic-0.39.jar PE \
  -threads 4 \
  -phred33 \
  input_forward.fastq.gz input_reverse.fastq.gz \
  output_forward_paired.fastq.gz output_forward_unpaired.fastq.gz \
  output_reverse_paired.fastq.gz output_reverse_unpaired.fastq.gz \
  ILLUMINACLIP:$TRIMMOMATIC_HOME/adapters/TruSeq3-PE.fa:2:30:10 \
  LEADING:3 \
  TRLING:3 \
  SLIDINGWINDOW:4:15 \
  MINLEN:36

参数说明

• SE 或 PE：指定输入数据的类型，SE 表示单端数据，PE 表示双端数据。
• -threads：指定使用的线程数。
• -phred33 或 -phred64：指定输入数据的质量编码格式，通常为 phred33。
• input.fastq.gz：输入文件，可以是压缩格式（.gz）或未压缩格式。
• output.fastq.gz：输出文件，修剪后的数据将保存到此文件中。
• ILLUMINACLIP：指定接头序列文件，并设置相关参数。
• LEADING：去除序列开头质量低于指定值的碱基。
• TRLING：去除序列末尾质量低于指定值的碱基。
• SLIDINGWINDOW：使用滑动窗口方法去除低质量碱基。
• MINLEN：去除长度小于指定值的序列。

常用参数详解

ILLUMINACLIP

ILLUMINACLIP 参数用于去除接头序列。其语法如下：

ILLUMINACLIP:<fastaWithAdaptersEtc>:<seed mismatches>:<palindrome clip threshold>:<simple clip threshold>

• <fastaWithAdaptersEtc>：包含接头序列的 FASTA 文件路径。
• <seed mismatches>：允许的种子序列错配数。
• <palindrome clip threshold>：回文模式下的剪切阈值。
• <simple clip threshold>：简单模式下的剪切阈值。

LEADING 和 TRLING

LEADING 和 TRLING 参数分别用于去除序列开头和末尾的低质量碱基。其语法如下：

LEADING:<quality>
TRLING:<quality>

• <quality>：质量阈值，低于此值的碱基将被去除。

SLIDINGWINDOW

SLIDINGWINDOW 参数使用滑动窗口方法去除低质量碱基。其语法如下：

SLIDINGWINDOW:<windowSize>:<requiredQuality>

• <windowSize>：滑动窗口的大小。
• <requiredQuality>：窗口内碱基的平均质量必须达到此值，否则窗口内的碱基将被去除。

MINLEN

MINLEN 参数用于去除长度小于指定值的序列。其语法如下：

MINLEN:<length>

• <length>：序列的最小长度，低于此长度的序列将被去除。

实际应用案例

案例 1：单端数据修剪

假设我们有一个单端测序数据文件 input.fastq.gz，我们希望去除接头序列、低质量碱基以及长度小于 36 的序列。可以使用以下命令：

java -jar $TRIMMOMATIC_HOME/trimmomatic-0.39.jar SE \
  -threads 4 \
  -phred33 \
  input.fastq.gz \
  output.fastq.gz \
  ILLUMINACLIP:$TRIMMOMATIC_HOME/adapters/TruSeq3-SE.fa:2:30:10 \
  LEADING:3 \
  TRLING:3 \
  SLIDINGWINDOW:4:15 \
  MINLEN:36

案例 2：双端数据修剪

假设我们有一对双端测序数据文件 input_forward.fastq.gz 和 input_reverse.fastq.gz，我们希望去除接头序列、低质量碱基以及长度小于 36 的序列。可以使用以下命令：

java -jar $TRIMMOMATIC_HOME/trimmomatic-0.39.jar PE \
  -threads 4 \
  -phred33 \
  input_forward.fastq.gz input_reverse.fastq.gz \
  output_forward_paired.fastq.gz output_forward_unpaired.fastq.gz \
  output_reverse_paired.fastq.gz output_reverse_unpaired.fastq.gz \
  ILLUMINACLIP:$TRIMMOMATIC_HOME/adapters/TruSeq3-PE.fa:2:30:10 \
  LEADING:3 \
  TRLING:3 \
  SLIDINGWINDOW:4:15 \
  MINLEN:36

总结

Trimmomatic 是一个功能强大且易于使用的测序数据预处理工具。通过合理设置参数，可以有效地去除低质量碱基、接头序列以及其它不需要的序列，从而提高后续分析的质量和准确性。本文介绍了 Trimmomatic 的安装、基本使用方法、常用参数以及实际应用案例，希望能帮助读者更好地理解和使用这一工具。