如何进行全基因组数据CNV分析

引言

拷贝数变异（Copy Number Variation, CNV）是指基因组中某些区域的拷贝数发生增加或减少的现象。CNV在人类基因组中广泛存在，并且与多种疾病、表型变异以及进化过程密切相关。随着高通量测序技术的发展，全基因组测序（Whole Genome Sequencing, WGS）已成为研究CNV的重要工具。本文将详细介绍如何进行全基因组数据CNV分析，包括数据预处理、CNV检测、结果解读和可视化等步骤。

数据预处理

1. 数据获取

全基因组测序数据通常以FASTQ格式存储，包含测序读段（reads）的序列信息。在进行CNV分析之前，首先需要获取这些原始数据。

2. 数据质量控制

数据质量控制是确保后续分析准确性的关键步骤。常用的工具包括FastQC和MultiQC，用于评估测序数据的质量，如读段长度、碱基质量分布、GC含量等。

fastqc sample.fastq.gz
multiqc .

3. 数据比对

将测序读段比对到参考基因组是CNV分析的基础。常用的比对工具包括BWA、Bowtie2和STAR。比对结果通常以BAM格式存储。

bwa mem reference.fa sample.fastq.gz > sample.sam
samtools view -bS sample.sam > sample.bam
samtools sort sample.bam -o sample.sorted.bam
samtools index sample.sorted.bam

4. 比对后处理

比对后处理包括去除重复读段、局部重比对和碱基质量重校正等步骤。常用的工具包括Picard和GATK。

java -jar picard.jar MarkDuplicates I=sample.sorted.bam O=sample.dedup.bam M=sample.metrics.txt
java -jar GenomeAnalysisTK.jar -T RealignerTargetCreator -R reference.fa -I sample.dedup.bam -o sample.intervals
java -jar GenomeAnalysisTK.jar -T IndelRealigner -R reference.fa -I sample.dedup.bam -targetIntervals sample.intervals -o sample.realigned.bam
java -jar GenomeAnalysisTK.jar -T BaseRecalibrator -R reference.fa -I sample.realigned.bam -knownSites dbsnp.vcf -o sample.recal_data.table
java -jar GenomeAnalysisTK.jar -T PrintReads -R reference.fa -I sample.realigned.bam -BQSR sample.recal_data.table -o sample.recalibrated.bam

CNV检测

1. 基于读段深度的CNV检测

基于读段深度的CNV检测方法通过统计基因组不同区域的读段覆盖深度来推断CNV。常用的工具包括CNVnator、Control-FREEC和DELLY。

cnvnator -root sample.root -tree sample.recalibrated.bam
cnvnator -root sample.root -his 100 -d reference_dir
cnvnator -root sample.root -stat 100
cnvnator -root sample.root -partition 100
cnvnator -root sample.root -call 100 > sample.cnv.txt

2. 基于读段对的CNV检测

基于读段对的CNV检测方法通过分析读段对的插入片段大小和方向来检测CNV。常用的工具包括BreakDancer和Lumpy。

breakdancer-max -o sample.breakdancer.txt sample.recalibrated.bam
lumpyexpress -B sample.recalibrated.bam -o sample.lumpy.vcf

3. 基于组装的方法

基于组装的方法通过将测序读段组装成连续的序列，然后与参考基因组进行比较来检测CNV。常用的工具包括SPAdes和Canu。

spades.py -o sample_assembly -1 sample_1.fastq.gz -2 sample_2.fastq.gz
canu -p sample -d sample_assembly genomeSize=3g -pacbio-raw sample.fastq.gz

结果解读

1. CNV注释

CNV注释是将检测到的CNV与已知的基因、功能元件和疾病关联进行比对。常用的工具包括Annovar和VEP。

annovar/annotate_variation.pl -buildver hg19 -out sample -dbtype refGene sample.cnv.txt annovar/humandb/
vep -i sample.cnv.vcf -o sample.vep.vcf --cache --dir_cache /path/to/cache --species homo_sapiens

2. CNV功能分析

CNV功能分析旨在理解CNV对基因功能和表型的影响。常用的方法包括基因集富集分析（GSEA）和通路分析。

gsea-cli.sh GSEA -res sample.gct -cls sample.cls -gmx sample.gmx -out sample_gsea

3. CNV与疾病关联分析

CNV与疾病关联分析旨在识别与特定疾病相关的CNV。常用的方法包括病例-对照研究和全基因组关联分析（GWAS）。

plink --bfile sample --cnv-list sample.cnv.txt --cnv-test --out sample_cnv_assoc

结果可视化

1. CNV图谱

CNV图谱是展示基因组中CNV分布的可视化工具。常用的工具包括Circos和IGV。

circos -conf circos.conf
igv.sh -g hg19 sample.bam sample.cnv.txt

2. CNV热图

CNV热图用于展示多个样本中CNV的分布和频率。常用的工具包括Heatmap.2和ComplexHeatmap。

library(ComplexHeatmap)
heatmap.2(cnv_matrix, scale="row", col=colorRampPalette(c("blue", "white", "red"))(100))

3. CNV网络分析

CNV网络分析用于展示CNV之间的相互作用和调控关系。常用的工具包括Cytoscape和Gephi。

cytoscape.sh -N sample.cnv.network

结论

全基因组数据CNV分析是一个复杂但强大的工具，能够揭示基因组结构变异与表型、疾病之间的关联。通过数据预处理、CNV检测、结果解读和可视化等步骤，研究人员可以深入理解CNV的功能和影响。随着技术的不断进步，CNV分析将在基因组学和精准医学中发挥越来越重要的作用。

参考文献

1. Alkan, C., Coe, B. P., & Eichler, E. E. (2011). Genome structural variation discovery and genotyping. Nature Reviews Genetics, 12(5), 363-376.
2. Mills, R. E., Walter, K., Stewart, C., Handsaker, R. E., Chen, K., Alkan, C., … & Eichler, E. E. (2011). Mapping copy number variation by population-scale genome sequencing. Nature, 470(7332), 59-65.
3. Sudmant, P. H., Rausch, T., Gardner, E. J., Handsaker, R. E., Abyzov, A., Huddleston, J., … & Eichler, E. E. (2015). An integrated map of structural variation in 2,504 human genomes. Nature, 526(7571), 75-81.

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以上是关于如何进行全基因组数据CNV分析的详细步骤和方法。希望本文能为从事基因组学研究的科研人员提供有价值的参考。